• Gustav Kovac

Poznámky k patofyziologickému a klinickému kontextu COVID-19 so zameraním na laboratórnu diagnostiku


Gustáv Kováč, Anna Porubenová, Michal Farkaš, Pavel Blažíček, Stanislav Oravec, Štefan Kečkéš, Alena Kristova

Ústav chémie, klinickej biochémie a laboratórnej medicíny LF SZU Bratislava

Úvod

Cieľom poznámok

  • je poskytnutie aktuálnych informácií o ochorení COVID-19 so zameraním na oblasť laboratórnej diagnostiky

Sústreďujeme sa na

  • podstatu

  • stručnosť

  • prehľadnosť textu

Problematika je aktuálna a vo vývoji, preto informácie

  • nie sú definitívne

  • nemôžu byť vyčerpávajúce

Metóda

V časti “Výsledky“ sa vyjadrujeme k

  • patofyziologickému kontextu

  • klinickému kontextu

a zameriavame sa

  • na možnosti laboratórnej diagnostiky COVID-19.

V časti „Diskusia“ sa vyjadrujeme k

  • ďalším aspektom pertraktovanej problematiky

Na záver uvádzame

  • súhrn poznatkov

  • odporúčania

  • zoznam použitej literatúry.

Výsledky

Poznámky k patofyziologickému kontextu

COVID-19 = COrona VIrus Disease 19

  • názov ochorenia dolných dýchacích ciest (MKCH: U07.1)

  • alternatívny názov ochorenia SARS-CoV-2 infection

SARS-CoV-2 = Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2

  • názov vírusu – etiologického agens

Vírus SARS-CoV-2

  • patrí do čeľade koronavírusov, častých pôvodcov nádchy

  • koronavírusy sú obalené, pleomorfné alebo sférické

  • rozmery viriónu: 150 – 160 nm

  • genóm vírusu tvorí ~30 kb a kóduje ~9860 aminokyselín

  • virión obsahuje: (+)ssRNA, Spike (S) glykoproteín, nukleokapsid (N) fosfoproteín, membránový (M) proteín, Small Envelope (E) glykoproteín, Obal (Envelope)

Poznámky ku klinickému kontextu

Prenos infekcie

  • vírus sa prenáša z človeka na človeka, sekundárne kvapôčkami (vzduchom) alebo kontaminovanými predmetmi

  • riziko je najvyššie počas symptomatickej fázy

  • prenos je možný tiež v pre-symptomatickej fáze, obyčajne 4 – 6 dní pred objavením sa symptómov

  • existujú správy o možnom prenose aj po ústupe príznakov

  • za rizikové (kontaminované) možno pokladať aj všetky biologické materiály od infikovaného pacienta, vírus sa vylučuje stolicou

Inkubačná doba

  • 2 – 14 dní

Vírus postihuje pľúca (pneumónia)

  • menovite alveolárne epiteliálne bunky (pneumocyty typ 2)

  • na membránach alveolárnych buniek sa vyskytuje receptor s afinitou k vírusu

za možný receptor sa pokladá Angiotenzín-konvertáza (ACE2)

vírus preniká do bunky za pomoci vírusového S-proteínu

  • koncentrácia receptoru v bunkovej membráne sa s vekom zvyšuje (riziko fatálnej pneumónie)

Hlavné príznaky ( symptómy )

  • vyplývajúce z pneumónie: horúčka, kašeľ, dýchavica, obraz pneumónie na zobrazovacích vyšetreniach

Nešpecifické príznaky:

  • myalgia, únava, neobvyklé záchvaty bolestí hlavy

Priebeh ochorenia pacientov

  • 80% mierny, 15% ťažký, 5% kritický

Riziko progresie k ťažkému priebehu

  • pacienti nad 60 rokov

  • komorbidity (malignita, DM, KVS ochorenia, chronické respiračné ochorenia)

Poznámky k možnostiam laboratórnej diagnostiky

Možnosti laboratórnej diagnostiky COVID-19

  • RT-PCR alebo iné amplifikačné metódy

  • detekcia vírusového antigénu

  • detekcia protilátok IgG, IgA, IgM

  • sekvenácia vírusového genómu

  • kultivácia na bunkových kultúrach

Typy vzoriek

  • orofaryngeálny ster (32%)

  • nasofaryngeálny ster (63%)

  • spútum

  • vzorky z dolných dýchacích ciest

Poznámky k real time reverznej transkriptáze PCR (rRT-PCR)

Poznámky ku RNA extrakcii

  • špecifická platforma na extrakciu nukleových kyselín

  • špecifický kit pre RNK extrakciu

  • manuálna extrakcia

  • teplota 98oC, 10 min

Poznámky ku génovej amplifikácii

Gény na amplifikáciu

  • N gén

  • E and RDRp gény

  • Orf 1 ab and N

Senzitivita a špecificita závisí na

  • type primérov

  • kvalite vzorky

Príčiny falošnej negativity

  • nízka kvalita vzorky

  • príliš včasný odber vzorky

  • nesprávny transport a skladovanie vzorky

  • technické príčiny ( mutácia vírusu ) + ( PCR inhibícia )

Iné amplifikačné systémy

Reverzná transkriptáza

  • „loop mediated isothermal amplification“ ( 30 min )

Integrované systémy

  • STAT-DX ( Qiagen )

  • Xpert Xpress Sars-Cov-2 ( Cepheid )

  • Filmarray ( Bio Merieux )

Poznámky k detekcii protilátok ( IgA, IgM, IgG )

Lateral flow / ELISA / Chemiluminiscencia

Kinetika

  • imunitná odpoveď začína okolo 5-6 dňa po infekcii

  • IgA - neexistuje veľa prác

Stanovenia

  • kolorimetrické versus fluorimetrické

  • vysoká variabilita rozličných kitov

Senzitivita

  • nízka počas prvých dní

  • po 10 dňoch sa zvyšuje na hodnotu okolo 70%

Jednotky intenzívnej starostlivosti

  • dekongescia

Poznámky k detekcii antigénu ( lateral flow )

Stanovenie

  • fotometrické ( coloidal gold )

  • fluorimetrické

Senzitivita

  • menej ako 50%

  • závisí na „viral load“

Poznámky k podpornej laboratórnej diagnostike

Zápalové parametre

  • hsCRP

  • IL-6

  • FW

  • feritín

Koagulačné parametre

  • PT

  • APTT

  • D-dimér

Rutínne biochemické parametre

  • AST, ALT

  • albumín, prealbumín

  • urea, kreatinín

  • glukóza

  • CK-MB

  • cholínesteráza

  • cystatín C

  • LDH

  • HBDH

  • LDL

Diskusia

K patogenéze COVID-19

Fáza

  1. vírusová

  2. zápalovej reakcie hostiteľa

Štádium

  1. včasnej infekcie

  2. pulmonárne

  3. hyperinflamačné

Ku vzťahu patogenézy a diagnostiky COVID-19

Štádium I ( vírusová fáza )

  • Klinika: horúčka, kašeľ, hnačka, bolesti hlavy

  • Laboratórium: lymfopénia, zvýšené PT, D-dimer a LDH

Štádium II ( vírusová fáza / fáza zápalovej reakcie hostiteľa )

  • Klinika: dyspnoe

  • Laboratórium: hypoxia, patologický rtg nález na pľúcach, zvýšené transaminázy, znížený prokalcitonín

Štádium III ( fáza zápalovej reakcie hostiteľa )

  • Klinika: ARDS, SARS, šok, kardiálna insuficiencia

  • Laboratórim: zvýšené CRP, LDH, IL-6, D dimer, feritín, troponín, NT-proBNP

K Reverse Real-Time PCR ( rRT PCR ):

  • ide o kvantitatívne vyšetrenie kópií NK vírusu SARS-CoV-2 z nazofaryngeálneho a orofaryngeálneho steru (prípadne iných biologických materiálov)

  • poznanie kompletného genómu SARS-CoV-2 umožnilo identifikáciu špecifických primérov a vytvorenie štandardných vyšetrovacích protokolov

  • nakoľko sa jedná o RNK vírus, na amplifikáciu a získanie komplementárnej cDNA sa využíva enzým reverzná transkriptáza ( RT )

K cieľom ( targets ) ktoré možno detegovať metodikou ( rRT PCR ):

  • RNA-dependentná RNA 96 polymeráza ( RdRp ) / helikáza ( Hel )

  • LoD: 11,2 RNA kópií pri senzitivite 95%

  • vysoká špecificita (nebola dokázaná skrížená reaktivita)

  • metodika implementová vo >30 laboratóriách v Európe

  • RNA-dependentná RNA 96 polymeráza-Probe 2 ( RdRp-P2 )

  • LoD: 3,8 RNA kópií pri senzitivite 95%

  • možná skrížená reaktivita s SARS-CoV

  • Envelope ( E ) gén

  • manuálne spracovanie - LoD: 5,2 RNA kópií pri senzitivite 95%

  • Roche Cobas 6800 - LoD: 275,72 kópií pri 95% senzitivite

  • jediný target plne automatizovanej metodiky

  • Nukleokapsidový ( N ) gén

  • LoD: 8,3 RNA kópií pri senzitivite 95%

K interpretácii výsledkov

  • pacienti s ťažkým priebehom majú až 60-násobne väčšiu vírusovú nálož ( viral load ), prítomnosť vírusovej RNA možno dokázať aj po 10 dňoch od začiatku príznakov

  • vyšší viral load je asociovaný respiračným zlyhávaním, potrebou UPV, poruchou pečeňových funkcií a smrťou

  • 90% pacientov s miernym priebehom dosiahne RT-PCR negativitu po 10 dňoch od začiatku príznakov

  • negatívne výsledky nevylučujú infekciu

  • interpretácia laboratórneho výsledku musí prebiehať súčasne s posudzovaním klinického obrazu

K interpretácii výsledkov pomocnej laboratórnej diagnostiky

Najčastejšie rutínne hematologické a biochemické patologické laboratórne nálezy

Znížené hodnoty

  • lymfocyty / lymfopénia ( 35-75% )

  • albumín / hypoalbuminémia ( 50-100% )

  • hemoglobín / anémia ( 40-50% )

Zvýšené hodnoty

  • C-reaktívny proteín CRP ( 75-95 % )

  • laktát-dehydrogenáza LDH ( 30-90% )

  • rychlosť sedimentácie erytrocytov FW (85%)

  • D-dimér ( 35-45 % )

Najvýznamnejšie prediktory ťažkého priebehu COVID-19

Znížené hodnoty

  • lymfocyty / lymfopénia

  • albumín/hypoalbuminémia

Zvýšené hodnoty

  • neutrofily/neutrofília

  • laktát-dehydrogenáza LDH

  • transaminázy AST, ALT

  • troponín

  • prokalcitonín

  • C-reaktívny proteín CRP

Porovnanie mortality

  • MERS ( Middle East Respiratory Syndrom ) 35%

  • SARS ( Severe Acute Respiratory Syndrom ) 10%

  • COVID-19 ( Corona Virus Disease 19 ) 5%

Distribúcia mortality

  • < 10 rokov < 1%

  • 10-20 rokov 1%

  • 20-30 rokov 10%

  • 30-80 rokov 90%

  • > 80 rokov 5%

K multidisciplinárnej spolupráci

Je nevyhnutná spolupráca

  • vedenia inštitúcie

  • infektológie

  • internej medicíny

  • pneumológie

  • intenzívnej starostlivosti

  • pediatriae

  • klinického laboratória

K manažmentu pacienta

Pri respiračnej symptomatológii alebo horúčke

Vyšetrenie COVID-19

  • Pozitívne: izolácia na COVID-19 oddelení

  • Negatívne: zopakovať vyšetrenie ( ak je výsledok negatívny zaradiť na normálne oddelenie )

Pri iných príznakoch

( v prípade prijatia )

COVID-19 vyšetrenie

  • Pozitívny: izolácia na COVID-19 oddelení

  • Negatívny: bežná starostlivosť

K terapii v štádiu

  1. včasnej infekcie - podávať antivirotiká

  2. pulmonálnom - podávať antivirotiká + immunosupresíva

  3. hyperinflamačnom - podávať imunospresíva

K liekom

Antivirotiká

  • lopinavir, hydroxychlorochín, remdesivir

Imunosupresíva

  • kortikosteroidy, IL inhibítory

Nízkomolekulárny heparín

  • v prípade koagulopatie

Záver

COVID-19

  • je ochorenie spôsobené vírusom SARS-CoV-2, ktorý sa prenáša kvapôčkami a postihuje pľúca

Horúčka, kašeľ a únava

  • sú hlavné klinické príznaky

Inkubačná doba

  • je do dvoch týždňov

Riziko prenosu

  • je hlavne v symptomatickej fáze, možnosť je aj v pre- a post-symptomatickej fáze

Priebeh ochorenia

  • v 80% prípadov mierny, v 20% ťažký až kritický

Ohrození

  • sú hlavne starší pacienti s komorbiditami

Mortalita COVID-19

  • je v porovnaní s mortalitou SARS a MERS najnižšia

Použitie metódy rRT PCR s využitím reverznej transkriptázy

  • v rámci laboratórnej diagnostiky predstavuje metódou voľby

Niektoré rutínne hematologické a biochemické parametre

  • sú užitočné hlavne v kontexte predikcie ťažkého priebehu

Výzvou

  • je diferenciálna diagnostika COVID-19 voči chrípke a iným bežným respiračným infekciám

Doporučenia

Kvalitná vzorka

  • je základný predpokladom spoľahlivého výsledku

PCR

  • predstavuje v súčasnosti metódou voľby

Detekcia antigénu

  • by predstavovala ideálny prístup na rýchlu diagnostiku, ale musela by mať podstatne vyššiu senzitivitu

Vyšetrenie protilátok

  • je komplementárne vyšetrenie za predpokladu senzitivity viac ako 70% a po uplynutí viac ako 5 dní od nástupu symptomatológie

V kontexte vyššie uvedeného vidíme možnosti využitia rýchlotestov ( hlavne protilátok IgM, IgG ) v týchto prípadoch:

  • pacienti na jednotkách intenzívnej terapie alebo hospitalizovaní po viac ako uplynutí 5 dní od nástupu symptomatológie

  • pacienti s opakovane negatívnymi výsledkami vyšetrenia PCR ( za účelom potvrdenia infekcie, ak je podozrenie na falošnú negativitu PCR )

  • detekcia protilátok u zdravotníckeho personálu ( hlavne za účelom identifikácie už imunizovaných – prítomnosť IgG )

  • pochopenie epidemiologickej situácie ( postavenie / úloha asymptomatickej infekcie )

  • identifikácia vysoko reaktívnych donorov, ktorí vytvárajú hyperimúnne sérum za účelom terapeutického postupu )

  • klinické pokusy / plazma imunizovaných pacientov

  • hodnotenie účinku vakcinácie ( do budúcna )

Literatúra

  • Lippi G, Plebani M: Laboratory abnormalities in patients with COVID 2019 infection, Clin Chem Lab Med. 2020 Mar 3. doi: 10.155/cclm-2020-0198 ( E pub )

  • Center for Diseases Control and Prevention: Interim Guidelines for Collecting, Handling and testing Clinical Specimens from Patients for Coronavirus Disease 2019

  • Wu Z., Mc Gregor JM: Characteristics and Important Lessons From teh Coronavirus Disease 2019 ( COVID-19 ): Outbrake in China: Summary of a report of 72 314 Cases From the Chinese Center for Disease Control and Prevention: JAMA, 2020, Febr 24.doi:10.1001/jama.20202648 ( E pub )

  • Lippi G, Plebani M: The Novel Coronavirus ( 2019 nCoV ) outbreak: think the unthinkable and be prepared to face the challenge. Diagnosis ( Berl ).2020, Jan.28.doi:10.1515/dx-2020-0015. ( E pub )

  • WHO Coronavirus diseases 2019 ( COVID-19 ) Situation report-44

  • Mattiuzzi C, Lippi G: Which lessons shall we learn from the 2019 novel coronavirus outbreak ?, Ann Trans Med 2020, 8(3):48.

  • Thang H et all: Angiotensin converting enzyme 2 ( ACE2 )as a SARS-CoV-2-receptor: molecular mechanisms and potential therpautic target: Intensive Care Med., 2020, Mar 3.doi: 10.1007/s00134-020-05985-9 ( E pub )

  • Kannan S, Shaik syed ali P, Sheeza A, Hemalatha K. COVID-19 (Novel Coronavirus 2019) - recent trends. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2020;24(4):2006-2011.

  • Chan JF, Yip CC, To KK, et al. Improved molecular diagnosis of COVID-19 by the novel, highly sensitive and specific COVID-19-RdRp/Hel real-time reverse transcription-polymerase chain reaction assay validated and with clinical specimens. J Clin Microbiol. 2020;

  • Tan SS, Yan B, Saw S, et al. Practical laboratory considerations amidst the COVID-19 outbreak: early experience from Singapore. J Clin Pathol. 2020;

  • Pfefferle S, Reucher S, Nörz D, Lütgehetmann M. Evaluation of a quantitative RT-PCR assay for the detection of the emerging coronavirus SARS-CoV-2 using a high throughput system. Euro Surveill. 2020;25(9)

  • Corman VM, Landt O, Kaiser M, et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020;25(3)


11 views