Poznámky k patofyziologickému a klinickému kontextu COVID-19 so zameraním na laboratórnu diagnostiku

Gustáv Kováč, Anna Porubenová, Michal Farkaš, Pavel Blažíček, Stanislav Oravec, Štefan Kečkéš, Alena Kristova

Ústav chémie, klinickej biochémie a laboratórnej medicíny LF SZU Bratislava

Úvod

Cieľom poznámok

• je poskytnutie aktuálnych informácií o ochorení COVID-19 so zameraním na oblasť laboratórnej diagnostiky

Sústreďujeme sa na

• podstatu

• stručnosť

• prehľadnosť textu

Problematika je aktuálna a vo vývoji, preto informácie

• nie sú definitívne

• nemôžu byť vyčerpávajúce

Metóda

V časti “Výsledky“ sa vyjadrujeme k

• patofyziologickému kontextu

• klinickému kontextu

a zameriavame sa

• na možnosti laboratórnej diagnostiky COVID-19.

V časti „Diskusia“ sa vyjadrujeme k

• ďalším aspektom pertraktovanej problematiky

Na záver uvádzame

• súhrn poznatkov

• odporúčania

• zoznam použitej literatúry.

Výsledky

Poznámky k patofyziologickému kontextu

COVID-19 = COrona VIrus Disease 19

• názov ochorenia dolných dýchacích ciest (MKCH: U07.1)

• alternatívny názov ochorenia SARS-CoV-2 infection

SARS-CoV-2 = Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2

• názov vírusu – etiologického agens

Vírus SARS-CoV-2

• patrí do čeľade koronavírusov, častých pôvodcov nádchy

• koronavírusy sú obalené, pleomorfné alebo sférické

• rozmery viriónu: 150 – 160 nm

• genóm vírusu tvorí ~30 kb a kóduje ~9860 aminokyselín

• virión obsahuje: (+)ssRNA, Spike (S) glykoproteín, nukleokapsid (N) fosfoproteín, membránový (M) proteín, Small Envelope (E) glykoproteín, Obal (Envelope)

Poznámky ku klinickému kontextu

Prenos infekcie

• vírus sa prenáša z človeka na človeka, sekundárne kvapôčkami (vzduchom) alebo kontaminovanými predmetmi

• riziko je najvyššie počas symptomatickej fázy

• prenos je možný tiež v pre-symptomatickej fáze, obyčajne 4 – 6 dní pred objavením sa symptómov

• existujú správy o možnom prenose aj po ústupe príznakov

• za rizikové (kontaminované) možno pokladať aj všetky biologické materiály od infikovaného pacienta, vírus sa vylučuje stolicou

Inkubačná doba

• 2 – 14 dní

Vírus postihuje pľúca (pneumónia)

• menovite alveolárne epiteliálne bunky (pneumocyty typ 2)

• na membránach alveolárnych buniek sa vyskytuje receptor s afinitou k vírusu

za možný receptor sa pokladá Angiotenzín-konvertáza (ACE2)

vírus preniká do bunky za pomoci vírusového S-proteínu

• koncentrácia receptoru v bunkovej membráne sa s vekom zvyšuje (riziko fatálnej pneumónie)

Hlavné príznaky ( symptómy )

• vyplývajúce z pneumónie: horúčka, kašeľ, dýchavica, obraz pneumónie na zobrazovacích vyšetreniach

Nešpecifické príznaky:

• myalgia, únava, neobvyklé záchvaty bolestí hlavy

Priebeh ochorenia pacientov

• 80% mierny, 15% ťažký, 5% kritický

Riziko progresie k ťažkému priebehu

• pacienti nad 60 rokov

• komorbidity (malignita, DM, KVS ochorenia, chronické respiračné ochorenia)

Poznámky k možnostiam laboratórnej diagnostiky

Možnosti laboratórnej diagnostiky COVID-19

• RT-PCR alebo iné amplifikačné metódy

• detekcia vírusového antigénu

• detekcia protilátok IgG, IgA, IgM

• sekvenácia vírusového genómu

• kultivácia na bunkových kultúrach

Typy vzoriek

• orofaryngeálny ster (32%)

• nasofaryngeálny ster (63%)

• spútum

• vzorky z dolných dýchacích ciest

Poznámky k real time reverznej transkriptáze PCR (rRT-PCR)

Poznámky ku RNA extrakcii

• špecifická platforma na extrakciu nukleových kyselín

• špecifický kit pre RNK extrakciu

• manuálna extrakcia

• teplota 98oC, 10 min

Poznámky ku génovej amplifikácii

Gény na amplifikáciu

• N gén

• E and RDRp gény

• Orf 1 ab and N

Senzitivita a špecificita závisí na

• type primérov

• kvalite vzorky

Príčiny falošnej negativity

• nízka kvalita vzorky

• príliš včasný odber vzorky

• nesprávny transport a skladovanie vzorky

• technické príčiny ( mutácia vírusu ) + ( PCR inhibícia )

Iné amplifikačné systémy

Reverzná transkriptáza

• „loop mediated isothermal amplification“ ( 30 min )

Integrované systémy

• STAT-DX ( Qiagen )

• Xpert Xpress Sars-Cov-2 ( Cepheid )

• Filmarray ( Bio Merieux )

Poznámky k detekcii protilátok ( IgA, IgM, IgG )

Lateral flow / ELISA / Chemiluminiscencia

Kinetika

• imunitná odpoveď začína okolo 5-6 dňa po infekcii

• IgA - neexistuje veľa prác

Stanovenia

• kolorimetrické versus fluorimetrické

• vysoká variabilita rozličných kitov

Senzitivita

• nízka počas prvých dní

• po 10 dňoch sa zvyšuje na hodnotu okolo 70%

Jednotky intenzívnej starostlivosti

• dekongescia

Poznámky k detekcii antigénu ( lateral flow )

Stanovenie

• fotometrické ( coloidal gold )

• fluorimetrické

Senzitivita

• menej ako 50%

• závisí na „viral load“

Poznámky k podpornej laboratórnej diagnostike

Zápalové parametre

• hsCRP

• IL-6

• FW

• feritín

Koagulačné parametre

• PT

• APTT

• D-dimér

Rutínne biochemické parametre

• AST, ALT

• albumín, prealbumín

• urea, kreatinín

• glukóza

• CK-MB

• cholínesteráza

• cystatín C

• LDH

• HBDH

• LDL

Diskusia

K patogenéze COVID-19

Fáza

1. vírusová

2. zápalovej reakcie hostiteľa

Štádium

1. včasnej infekcie

2. pulmonárne

3. hyperinflamačné

Ku vzťahu patogenézy a diagnostiky COVID-19

Štádium I ( vírusová fáza )

• Klinika: horúčka, kašeľ, hnačka, bolesti hlavy

• Laboratórium: lymfopénia, zvýšené PT, D-dimer a LDH

Štádium II ( vírusová fáza / fáza zápalovej reakcie hostiteľa )

• Klinika: dyspnoe

• Laboratórium: hypoxia, patologický rtg nález na pľúcach, zvýšené transaminázy, znížený prokalcitonín

Štádium III ( fáza zápalovej reakcie hostiteľa )

• Klinika: ARDS, SARS, šok, kardiálna insuficiencia

• Laboratórim: zvýšené CRP, LDH, IL-6, D dimer, feritín, troponín, NT-proBNP

K Reverse Real-Time PCR ( rRT PCR ):

• ide o kvantitatívne vyšetrenie kópií NK vírusu SARS-CoV-2 z nazofaryngeálneho a orofaryngeálneho steru (prípadne iných biologických materiálov)

• poznanie kompletného genómu SARS-CoV-2 umožnilo identifikáciu špecifických primérov a vytvorenie štandardných vyšetrovacích protokolov

• nakoľko sa jedná o RNK vírus, na amplifikáciu a získanie komplementárnej cDNA sa využíva enzým reverzná transkriptáza ( RT )

K cieľom ( targets ) ktoré možno detegovať metodikou ( rRT PCR ):

• RNA-dependentná RNA 96 polymeráza ( RdRp ) / helikáza ( Hel )

• LoD: 11,2 RNA kópií pri senzitivite 95%

• vysoká špecificita (nebola dokázaná skrížená reaktivita)

• metodika implementová vo >30 laboratóriách v Európe

• RNA-dependentná RNA 96 polymeráza-Probe 2 ( RdRp-P2 )

• LoD: 3,8 RNA kópií pri senzitivite 95%

• možná skrížená reaktivita s SARS-CoV

• Envelope ( E ) gén

• manuálne spracovanie - LoD: 5,2 RNA kópií pri senzitivite 95%

• Roche Cobas 6800 - LoD: 275,72 kópií pri 95% senzitivite

• jediný target plne automatizovanej metodiky

• Nukleokapsidový ( N ) gén

• LoD: 8,3 RNA kópií pri senzitivite 95%

K interpretácii výsledkov

• pacienti s ťažkým priebehom majú až 60-násobne väčšiu vírusovú nálož ( viral load ), prítomnosť vírusovej RNA možno dokázať aj po 10 dňoch od začiatku príznakov

• vyšší viral load je asociovaný respiračným zlyhávaním, potrebou UPV, poruchou pečeňových funkcií a smrťou

• 90% pacientov s miernym priebehom dosiahne RT-PCR negativitu po 10 dňoch od začiatku príznakov

• negatívne výsledky nevylučujú infekciu

• interpretácia laboratórneho výsledku musí prebiehať súčasne s posudzovaním klinického obrazu

K interpretácii výsledkov pomocnej laboratórnej diagnostiky

Najčastejšie rutínne hematologické a biochemické patologické laboratórne nálezy

Znížené hodnoty

• lymfocyty / lymfopénia ( 35-75% )

• albumín / hypoalbuminémia ( 50-100% )

• hemoglobín / anémia ( 40-50% )

Zvýšené hodnoty

• C-reaktívny proteín CRP ( 75-95 % )

• laktát-dehydrogenáza LDH ( 30-90% )

• rychlosť sedimentácie erytrocytov FW (85%)

• D-dimér ( 35-45 % )

Najvýznamnejšie prediktory ťažkého priebehu COVID-19

Znížené hodnoty

• lymfocyty / lymfopénia

• albumín/hypoalbuminémia

Zvýšené hodnoty

• neutrofily/neutrofília

• laktát-dehydrogenáza LDH

• transaminázy AST, ALT

• troponín

• prokalcitonín

• C-reaktívny proteín CRP

Porovnanie mortality

• MERS ( Middle East Respiratory Syndrom ) 35%

• SARS ( Severe Acute Respiratory Syndrom ) 10%

• COVID-19 ( Corona Virus Disease 19 ) 5%

Distribúcia mortality

• < 10 rokov < 1%

• 10-20 rokov 1%

• 20-30 rokov 10%

• 30-80 rokov 90%

• > 80 rokov 5%

K multidisciplinárnej spolupráci

Je nevyhnutná spolupráca

• vedenia inštitúcie

• infektológie

• internej medicíny

• pneumológie

• intenzívnej starostlivosti

• pediatriae

• klinického laboratória

K manažmentu pacienta

Pri respiračnej symptomatológii alebo horúčke

Vyšetrenie COVID-19

• Pozitívne: izolácia na COVID-19 oddelení

• Negatívne: zopakovať vyšetrenie ( ak je výsledok negatívny zaradiť na normálne oddelenie )

Pri iných príznakoch

( v prípade prijatia )

COVID-19 vyšetrenie

• Pozitívny: izolácia na COVID-19 oddelení

• Negatívny: bežná starostlivosť

K terapii v štádiu

1. včasnej infekcie - podávať antivirotiká

2. pulmonálnom - podávať antivirotiká + immunosupresíva

3. hyperinflamačnom - podávať imunospresíva

K liekom

Antivirotiká

• lopinavir, hydroxychlorochín, remdesivir

Imunosupresíva

• kortikosteroidy, IL inhibítory

Nízkomolekulárny heparín

• v prípade koagulopatie

​

Záver

COVID-19

• je ochorenie spôsobené vírusom SARS-CoV-2, ktorý sa prenáša kvapôčkami a postihuje pľúca

Horúčka, kašeľ a únava

• sú hlavné klinické príznaky

Inkubačná doba

• je do dvoch týždňov

Riziko prenosu

• je hlavne v symptomatickej fáze, možnosť je aj v pre- a post-symptomatickej fáze

Priebeh ochorenia

• v 80% prípadov mierny, v 20% ťažký až kritický

Ohrození

• sú hlavne starší pacienti s komorbiditami

Mortalita COVID-19

• je v porovnaní s mortalitou SARS a MERS najnižšia

Použitie metódy rRT PCR s využitím reverznej transkriptázy

• v rámci laboratórnej diagnostiky predstavuje metódou voľby

Niektoré rutínne hematologické a biochemické parametre

• sú užitočné hlavne v kontexte predikcie ťažkého priebehu

Výzvou

• je diferenciálna diagnostika COVID-19 voči chrípke a iným bežným respiračným infekciám

Doporučenia

Kvalitná vzorka

• je základný predpokladom spoľahlivého výsledku

PCR

• predstavuje v súčasnosti metódou voľby

Detekcia antigénu

• by predstavovala ideálny prístup na rýchlu diagnostiku, ale musela by mať podstatne vyššiu senzitivitu

Vyšetrenie protilátok

• je komplementárne vyšetrenie za predpokladu senzitivity viac ako 70% a po uplynutí viac ako 5 dní od nástupu symptomatológie

V kontexte vyššie uvedeného vidíme možnosti využitia rýchlotestov ( hlavne protilátok IgM, IgG ) v týchto prípadoch:

• pacienti na jednotkách intenzívnej terapie alebo hospitalizovaní po viac ako uplynutí 5 dní od nástupu symptomatológie

• pacienti s opakovane negatívnymi výsledkami vyšetrenia PCR ( za účelom potvrdenia infekcie, ak je podozrenie na falošnú negativitu PCR )

• detekcia protilátok u zdravotníckeho personálu ( hlavne za účelom identifikácie už imunizovaných – prítomnosť IgG )

• pochopenie epidemiologickej situácie ( postavenie / úloha asymptomatickej infekcie )

• identifikácia vysoko reaktívnych donorov, ktorí vytvárajú hyperimúnne sérum za účelom terapeutického postupu )

• klinické pokusy / plazma imunizovaných pacientov

• hodnotenie účinku vakcinácie ( do budúcna )

Literatúra

• Lippi G, Plebani M: Laboratory abnormalities in patients with COVID 2019 infection, Clin Chem Lab Med. 2020 Mar 3. doi: 10.155/cclm-2020-0198 ( E pub )

• Center for Diseases Control and Prevention: Interim Guidelines for Collecting, Handling and testing Clinical Specimens from Patients for Coronavirus Disease 2019

• Wu Z., Mc Gregor JM: Characteristics and Important Lessons From teh Coronavirus Disease 2019 ( COVID-19 ): Outbrake in China: Summary of a report of 72 314 Cases From the Chinese Center for Disease Control and Prevention: JAMA, 2020, Febr 24.doi:10.1001/jama.20202648 ( E pub )

• Lippi G, Plebani M: The Novel Coronavirus ( 2019 nCoV ) outbreak: think the unthinkable and be prepared to face the challenge. Diagnosis ( Berl ).2020, Jan.28.doi:10.1515/dx-2020-0015. ( E pub )

• WHO Coronavirus diseases 2019 ( COVID-19 ) Situation report-44

• Mattiuzzi C, Lippi G: Which lessons shall we learn from the 2019 novel coronavirus outbreak ?, Ann Trans Med 2020, 8(3):48.

• Thang H et all: Angiotensin converting enzyme 2 ( ACE2 )as a SARS-CoV-2-receptor: molecular mechanisms and potential therpautic target: Intensive Care Med., 2020, Mar 3.doi: 10.1007/s00134-020-05985-9 ( E pub )

• Kannan S, Shaik syed ali P, Sheeza A, Hemalatha K. COVID-19 (Novel Coronavirus 2019) - recent trends. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2020;24(4):2006-2011.

• Chan JF, Yip CC, To KK, et al. Improved molecular diagnosis of COVID-19 by the novel, highly sensitive and specific COVID-19-RdRp/Hel real-time reverse transcription-polymerase chain reaction assay validated and with clinical specimens. J Clin Microbiol. 2020;

• Tan SS, Yan B, Saw S, et al. Practical laboratory considerations amidst the COVID-19 outbreak: early experience from Singapore. J Clin Pathol. 2020;

• Pfefferle S, Reucher S, Nörz D, Lütgehetmann M. Evaluation of a quantitative RT-PCR assay for the detection of the emerging coronavirus SARS-CoV-2 using a high throughput system. Euro Surveill. 2020;25(9)

• Corman VM, Landt O, Kaiser M, et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020;25(3)