Autori
G. Kováč, A. Porubenová, S. Oravec, Š. Kečkéš, A. Kristová, M. Farkaš, P. Blažíček
Kľúčové slová
algoritmy – COVID-19 – klinický protokol - laboratórna diagnostika – POCT – rRT PCR – serológia – ŠDP/SOP
Zoznam skratiek a vymedzenie základných pojmov
ALT ( Alanín-aminotransferáza; Alanin Amino Transferase )
AST ( Aspartát-aminotransferáza; Aspartate Amino Transferase )
COVID-19 ( Corona Virus Disease 19 )
CRP ( C-reaktívny proteín, C-Reactive Protein )
IgG ( Imunoglobulín G; Immunoglobulin G )
IgM ( Imunoglobulín M; Immunoglobulin M )
LDH ( Laktát dehydrogenáza; Lactate Dehydrogenase )
MERS ( Middle East Respiratory Syndrom )
NT-proBNP ( N-terminal pro B Natriuretic Peptide )
PCR ( Polymerázová reťazová reakcia; Polymerase Chain Raction )
POCT ( Point Of Care Testing )
rRT-PCR ( Real-time reverse-transcriptase-polymerase chain reaction )
RLP ( Rýchla Lekárska Pomoc )
RT ( Reverzná transkriptáza; Reverse Transcriptase )
RZP ( Rýchla Zdravotnícka Pomoc )
SARS ( Severe Acute Respiratory Syndrom )
ŠDP ( Štandardné diagnostické postupy )
SOP ( Štandardné operačné postupy; Standard Operating Procedure )
VL ( Všeobecný lekár )
ZS ( Zdravotná starostlivosť )
Kompetencie
Na základe výzvy NZ SR hlavným odborníkom
zo 6. 5. 2020 sa sústreďujeme na problematiku
klinického protokolu,
diagnostických algoritmov
ŠDP/SOP
z pohľadu laboratórnej diagnostiky
Laboratórnu diagnostiku COVID-19 v súlade s platnou legislatívou
garantujú a realizujú lekári, laboratórni diagnostici a laboranti v špecializačných odboroch
225 – laboratórna medicína: v plnom rozsahu včítane PCR testovania
024 – klinická biochémia
040 – klinická imunológia a alergológia, pokiaľ ide o sérológické testovanie na automatických analyzátoroch
Úvod
COVID-19 = COrona VIrus Disease 19
názov ochorenia dolných dýchacích ciest (MKCH: U07.1)
alternatívny názov ochorenia SARS-CoV-2 infection
SARS-CoV-2 = Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2
názov vírusu – etiologického agens
Vyjadrujeme sa
k možnostiam laboratórnej diagnostiky
k situáciám v ktorých sa môže ocitnúť pacient
alebo poskytovateľ ZS
ako aj k manažmentu ( skôr kritériám kategorizácie ) pacientov COVID-19
pozitívny
negatívny
suspektný
v karanténe ( domácej / štátnej )
Prevencia
Fázy ochorenia
vírusová
zápalovej reakcie hostiteľa
Štádiá ochorenia
včasnej infekcie
pulmonárne
hyperinflamačné
Z hľadiska klasifikácie biologických organizmov podľa rizika ohrozenia laboratórneho personálu
Úroveň 1 organizmy bežne nie sú príčinou ochorenia
Úroveň 2 organizmy sú príčinou bežných ochorení
Úroveň 3 organizmy, ktoré bežne nenachádzame v rutínnom laboratóriu
napr.: arbo- a arenavírusy, mycobacterium tuberculosis, pôvodcovia
systémových mykotických infekcií
Úroveň 4 bezpečnostná bunka s úplnou izoláciou a osobitnou vzduchotechnikou
napr.: filovírusy, ebola
Navrhujeme preventívne opatrenia na úrovni 3
Epidemiológia
Prenos infekcie
vírus sa prenáša z človeka na človeka, sekundárne kvapôčkami (vzduchom) alebo kontaminovanými predmetmi
riziko je najvyššie počas symptomatickej fázy
prenos je možný tiež v pre-symptomatickej fáze, obyčajne 4 – 6 dní pred objavením sa symptómov
existujú správy o možnom prenose aj po ústupe príznakov
za rizikové (kontaminované) možno pokladať aj všetky biologické materiály od infikovaného pacienta, vírus sa vylučuje stolicou
Inkubačná doba: 2 – 14 dní
Patofyziológia
Vírus SARS-CoV-2
patrí do čeľade koronavírusov, častých pôvodcov nádchy
koronavírusy sú obalené, pleomorfné alebo sférické
rozmery viriónu: 150 – 160 nm
genóm vírusu tvorí ~30 kb a kóduje ~9860 aminokyselín
virión obsahuje: (+)ssRNA, Spike (S) glykoproteín, nukleokapsid (N) fosfoproteín, membránový (M) proteín, Small Envelope (E) glykoproteín, Obal (Envelope)
Klasifikácia
Štádium I ( vírusová fáza )
Klinika: horúčka, kašeľ, hnačka, bolesti hlavy
Laboratórium: lymfopénia, zvýšené PT, D-dimer a LDH
Štádium II ( vírusová fáza / fáza zápalovej reakcie hostiteľa )
Klinika: dyspnoe
Laboratórium: hypoxia, patologický rtg nález na pľúcach, zvýšené transaminázy,
znížený prokalcitonín (? Nie je naopak zvýšený PCT)
Štádium III ( fáza zápalovej reakcie hostiteľa )
Klinika: ARDS, SARS, šok, kardiálna insuficiencia
Laboratórium: zvýšené CRP, LDH, IL-6, D dimer, feritín, troponín, NT-proBNP
Z hľadiska algoritmizácie laboratórnej diagnostiky rozlišujeme
Situácie v ktorých sa môže vyskytnúť pacient
bez klinických príznakov a podozrivého kontaktu
bez klinických príznakov s podozrivým kontaktom
s klinickými príznakmi infekčného ochorenia
s klinickými príznakmi iného ochorenia
s klinickými príznakmi oboch
Situácie v ktorých sa môže vyskytnúť poskytovateľ ZS
Ambulancia VL/pohotovosť
Ambulancia špecialistu
Centrálny príjem nemocnice
RZP, RLP
Nemocničné oddelenie
Klinické laboratórium
Lekáreň
Klinický obraz
Vírus postihuje pľúca (pneumónia)
menovite alveolárne epiteliálne bunky (pneumocyty typ 2)
na membránach alveolárnych buniek sa vyskytuje receptor s afinitou k vírusu
za možný receptor sa pokladá Angiotenzín-konvertáza (ACE2)
vírus preniká do bunky za pomoci vírusového S-proteínu
koncentrácia receptoru v bunkovej membráne sa s vekom zvyšuje (riziko fatálnej pneumónie)
Hlavné príznaky ( symptómy )
vyplývajúce z pneumónie: horúčka, kašeľ, dýchavica, tiež aj rtg obraz pneumónie na zobrazovacích vyšetreniach
Nešpecifické príznaky:
myalgia, únava, neobvyklé záchvaty bolestí hlavy
Priebeh ochorenia pacientov
80% mierny, 15% ťažký, 5% kritický
Riziko progresie k ťažkému priebehu
pacienti nad 60 rokov
komorbidity (malignita, DM, KVS ochorenia, chronické respiračné ochorenia )
Z hľadiska laboratórnej diagnostiky sa pacient na základe klinických a laboratórnych vyšetrení môže javiť ako
COVID-19 negat: (negatívny výsledok rRT-PCR)
COVID-19 susp. (anamnéza, klinické príznaky, POCT, sérológia, pomocné vyšetrenia)
COVID-19 pozit. (pozitívny výsledok rRT-PCR)
Diagnostika / Postup určenia diagnózy
Možnosti
RT-PCR alebo iné amplifikačné metódy
Imunochemická detekcia vírusového antigénu
v našich diagnostických podmienkach detekcia len IgM a IgG protilátok (sérológia)
sekvenácia vírusového genómu
kultivácia na bunkových kultúrach
Z hľadiska laboratórnej diagnostiky rozlišujeme
Molekulárne biologické metodiky
reverzná transkriptáza: rRT-PCR ( real-time reverse-transcriptase-polymerase chain reaction )
Sérologické metodiky
kvantitatívne stanovenie protilátok ( predovšetkým triedy IgM, IgG )
Metodiky POCT ( rýchlotesty )
identifikácia prítomnosti protilátok alebo antigénu
Podporné laboratórne vyšetrenia
fyzikálne, zobrazovacie, biochemické, hematologické, imunologické
diferenciálne diagnostické / monitorovacie vyšetrenia
Typy vzoriek
orofaryngeálny ster (32%)
nasofaryngeálny ster (63%)
spútum
vzorky biologického materiálu z dolných dýchacích ciest (BAL)
venózna krv (sérum, plazma)
moč
Poznámky k real time reverznej transkriptáze PCR (rRT-PCR)
Poznámky ku RNA extrakcii
Automatizovaná alebo manuálna extrakcia RNK
Špecifický kit pre RNK extrakciu
teplota 98oC, 10 min
Poznámky k amplifikáčným metódam
Gény vhodné na amplifikáciu: N gén, E gén, RDRp gény, Orf 1 ab gén
Senzitivita a špecificita závisí na type primérov a kvalite vzorky
Príčiny falošnej negativity vyšetrenia
nízka kvalita vzorky ( nesprávny odber, transport a skladovanie materiálu )
príliš včasný odber vzorky ( nízky viral load )
technické príčiny ( mutácia vírusu ) + ( PCR inhibícia )
Iné amplifikačné systémy
Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP)
výsledky sú dostupné do 30 minút od začatia amplifikácie
Integrované systémy
STAT-DX ( Qiagen )
Xpert Xpress Sars-Cov-2 ( Cepheid )
FilmArray ( Bio Merieux )
Detekcia protilátok ( IgM, IgG )
Lateral flow rapid test ( imunochromatografia ) / ELISA / Chemiluminiscencia (CLIA)
Kinetika
imunitná odpoveď začína okolo 5-6 dňa po infekcii ( IgM )
Stanovenia
kolorimetrické versus fluorimetrické
vysoká variabilita rozličných kitov
Senzitivita
nízka počas prvých dní
po 10 dňoch sa zvyšuje na hodnotu okolo 70%
Jednotky intenzívnej starostlivosti
dekongescia
Detekcia antigénu ( lateral flow )
Stanovenie
fotometrické ( coloidal gold )
fluorimetrické
Senzitivita
menej ako 50%
závisí na „viral load“
Liečba
Štádium
Včasnej infekcie antivirotiká
Pulmonálnom antivirotiká + immunosupresíva
Hyperinflamačnom imunospresíva
Lieky
Antivirotiká lopinavir, hydroxychlorochín, remdesivir
Imunosupresíva kortikosteroidy, IL inhibítory
V prípade koagulopatie nízkomolekulárny heparín (LMWH)
Z hľadiska laboratórneho monitoringu
Bez klinických príznakov a podozrivého kontaktu
laboratórna diagnostika nie je nutná
Bez klinických príznakov s podozrivým kontaktom
Individuálny výskyt
krok: rRT-PCR
krok: serológia
Masový výskyt ( naopak )
krok: serológia
krok: rRT-PCR v prípade pozitivity serológie
S klinickými príznakmi infekčného ochorenia
krok: rRT-PCR, pomocné vyšetrenia
krok: serológia
krok: rRT-PCR
S klinickými príznakmi iného ochorenia
krok: rRT-PCR, pomocné vyšetrenia, vyšetrenia zamerané na iné ochorenie
krok: serológia
krok: rRT-PCR
S klinickými príznakmi oboch
krok: rRT-PCR
krok: serológia
krok: rRT-PCR
Prognóza
Priebeh ochorenia
v 80% prípadov mierny,
v 20% ťažký až kritický
Najvýznamnejšie prediktory ťažkého priebehu COVID-19
Znížené hodnoty
lymfocyty / lymfopénia
albumín/hypoalbuminémia
Zvýšené hodnoty
neutrofily/neutrofília
laktát-dehydrogenáza (LDH)
transaminázy (AST, ALT)
troponín (TnI, TnT)
prokalcitonín (PCT)
C-reaktívny proteín (CRP)
Porovnanie mortality
MERS ( Middle East Respiratory Syndrome ) 35%
SARS ( Severe Acute Respiratory Syndrome ) 10%
COVID-19 ( Corona Virus Disease 19 ) 5%
Distribúcia mortality
< 10 rokov < 1%
10-20 rokov 1%
20-30 rokov 10%
30-80 rokov 90%
> 80 rokov 5%
Z hľadiska laboratórnej diagnostiky pre najbližšiu budúcnosť
Molekulárne biologické testy
treba považovať z hľadiska doterajších skúseností a hľadiska interpretácie laboratórneho výsledku za definitívne
sú aj najdrahšie ( > 10 EUR )
čas dodania výsledku ( tzv. turn-around-time ): do 24 hodín
Serologické testy ( IgM / IgG )
Z pohľadu doterajších informácií / skúseností
nie je jednoznačne definovaná skupina kvantitatívnych testov
dá sa nanajvýš rozlišovať medzi „tzv. semikvantitatívnymi“ a kvalitatívnymi
za predpokladu dodržania termínov indikácie: 5 dní od začiatku klinických príznakov / 14 dní od vymiznutia klinických príznakov je vyšetrenie na pomedzí skríningového a definitívneho vyšetrenia
vyšetrenie nestanovuje definitívnu diagnózu, avšak výsledok vyšetrenia významným spôsobom znižuje mieru neistoty
Charakteristiky
nenáročná predanalytická fáza: štandarný odber ako BCH
vysoká dostupnosť ( automatizované imunochemické analyzátory )
čas dodania výsledku: do 1-3 hodín
Z pohľadu nákladov
patria do kategórie ( „4 EUR“ ) „ových“
POCT / Rýchlotesty
Z pohľadu interpretácie laboratórneho výsledku
ich možno ich považovať za skríningové / orientačné
Z pohľadu doterajších skúseností
je ich najviac a sú najmenej spoľahlivé
čas dodania výsledku ( turn-around-time ): do 15 – 20 minút
Z pohľadu nákladov
ceny bývajú premrštené ( 10 EUR )
vzhľadom na spoľahlivosť a charakter by sa mali používať len tie, ktoré nestoja viac ako ( 1-2 EUR )
Stanovisko expertov (posudková činnosť, revízna činnosť, PZS a pod.)
Poskytovateľov s priamymi kontaktami s pacientmi alebo biologickým materiálom
Osoby
lekár
laboratórny diagnostik
laborant, sestra
sanitár
záchranár
lekárnik
Zariadenia / Inštitúcie
klinické laboratórium
ambulancia VL/pohotovosť
ambulancia špecialistu
centrálny príjem nemocnice
RZP, RLP
nemocničné oddelenie
lekáreň
treba považovať za „kategóriu bez klinických príznakov ale s podozrivým kontaktom“ ( skôr masového charakteru ).
Preto navrhujeme pravidelný monitoring / skríning
Prvý krok serológia
Druhý krok rRT-PCR (v prípade pozitivity serológie)
Frekvenciu by mal určiť epidemiológ podľa odhadu rizika
Vysoko rizikové sú
klinické laboratóriá v nemocniciach s infekčným oddelením
infekčné a pľúcne oddelenia
ambulancie VL, pohotovosti, oddelenia centrálneho príjmu, RZP a RLP
Zabezpečenie a organizácia starostlivosti
Je nevyhnutná spolupráca
vedenia inštitúcie
odd. infektológie
odd. internej medicíny
odd. pneumológie
odd. intenzívnej starostlivosti
pediatrického odd.
klinického laboratória
Z pohľadu laboratórnej diagnostiky ( charakter, interpretácia výsledku, náklady ) zdôrazňujeme rozlišovanie laboratórnych vyšetrení na
Definitívne
rRT-PCR
poskytujúce diagnostickú istotu
Znižujúce úroveň diagnostickej neistoty
( serológia IgM, IgG )
„t.č. semikvantitatívne“
POCT ( rýchlotesty )
najmenej spoľahlivé
vhodné na použitie len v špeciálnych situáciách a malom množstve
Doplnkové ( rutínna biochémia, hematológia, imunológia )
slúžiace na diferenciálnu diagnostiku a monitoring
Ďalšie odporúčania
Kvalitná vzorka je základný predpokladom spoľahlivého výsledku
PCR predstavuje v súčasnosti metódou voľby
Detekcia antigénu by predstavovala ideálny prístup na rýchlu diagnostiku, ale musela by mať podstatne vyššiu senzitivitu
Vyšetrenie protilátok (sérológia) je komplementárne vyšetrenie k PCR za predpokladu senzitivity vyšetrenia nad 70% a v čase odberu uplynulo viac ako 5 dní od nástupu symptomatológie
Z hľadiska vzťahu medzi klinickou a laboratórnou diagnostikou zdôrazňujeme význam
V 1. kroku rozlíšiť, či ide o podozrivý kontakt alebo nie
V 2. kroku zistiť, či pacient má klinické príznaky alebo nie
V 3. kroku rozhodnúť či ide o
príznaky infekčného ochorenia,
iného ochorenia
alebo oboch kategórií
Doplnkové otázky manažmentu pacienta a zúčastnených strán
Možnosti protilátok IgM, IgG
pacienti na jednotkách intenzívnej starostlivosti alebo hospitalizovaní po viac ako uplynutí 5 dní od nástupu symptomatológie
pacienti s opakovane negatívnymi výsledkami vyšetrenia PCR ( za účelom potvrdenia infekcie, ak je podozrenie na falošnú negativitu PCR )
detekcia protilátok u zdravotníckeho personálu ( hlavne za účelom identifikácie už imunizovaných – prítomnosť IgG )
všeobecní lekári / ambulancie prvého kontaktu ( pacienti s protrahujucim respiroinfektom, „červené ambulancie“, lekári, ktorí maju v dispenzári DSS )
pochopenie epidemiologickej situácie ( postavenie / úloha asymptomatickej infekcie )
identifikácia vysoko-reaktívnych donorov, ktorí vytvárajú hyperimúnne sérum za účelom terapeutického postupu )
klinické pokusy / plazma imunizovaných pacientov
hodnotenie účinku vakcinácie ( do budúcna )
Z hľadiska situácie poskytovateľa zdravotnej starostlivosti rozlišovať medzi
ambulanciou všeobecného lekára a špecialistu
nemocničným oddelením „normálnym“ a „infekčným“
klinickým laboratóriom v nemocnici s infekčným oddelením a v nemocnici bez infekčného oddelenia
a postupovať ako je uvedené v príslušnej časti „Liečba“
Alternatívne odporúčania
Pri respiračnej symptomatológii alebo horúčke
Vyšetrenie COVID-19
Pozitívne: izolácia na COVID-19 oddelení
Negatívne: zopakovať vyšetrenie ( ak je výsledok negatívny, preložit pacienta na
normálne oddelenie )
Pri iných príznakoch ( v prípade prijatia )
COVID-19 vyšetrenie
Pozitívny: izolácia na COVID-19 oddelení
Negatívny: štandardná starostlivosť
K štandardným diagnostickým postupom / Standard Operating Procedures ( ŠDP/ŠOP )
V súčasnosti
nie je dostatok skúseností na vypracovanie definitívnych ŠDP
Odporúčame
systematické zbieranie dát z porovnávacích štúdií
realizáciu porovnávacích štúdií molekulárne biologických a serlogických metodík
Špeciálny doplnok štandardu
Najčastejšie rutínne hematologické a biochemické patologické laboratórne nálezy
Znížené hodnoty
lymfocyty / lymfopénia ( 35-75% )
albumín / hypoalbuminémia ( 50-100% )
hemoglobín / anémia ( 40-50% )
Zvýšené hodnoty
C-reaktívny proteín CRP ( 75-95 % )
laktát-dehydrogenáza LDH ( 30-90% )
rýchlosť sedimentácie erytrocytov FW (85%)
D-dimér ( 35-45 % )
Z hľadiska integrovanej a konsolidovanej laboratórnej diagnostiky
Odporúčame
podporovať existujúce ako aj novovznikajúce oddelenia laboratórnej medicíny ktoré:
umožňujú spoluprácu monovalentných laboratórnych disciplín ( biochémia, hematológia, imunológia, mikrobiológia, genetika )
vedú k lacnejšej a kvalitnejšej laboratórnej diagnostike
Jedná sa o veľmi aktuálnu problematiku pre očakávaný ekonomicky prepad a nedostatok financií v zdravotníctve a ostatných rezortoch
V tejto súvislosti si dovoľujeme upozorniť na projekt „Referenčného laboratória MZSR“
na ktorom pracovala skupina pre štandardné diagnostické postupy v laboratórnej medicíne v spolupráci s MZ SR ( doc. MUDr. Andrea Kálavská PhD, MHA )
v období jún-november 2019
Odporúčania pre ďalší audit a revíziu ŠDP / SOP
Diferenciálna diagnostika COVID-19
voči chrípke a iným bežným respiračným infekciám
Ku kvantitatívnej serológii
Odporúčame
identifikovať spoľahlivý kvantitatívny serologický test
Realizovať za týmto účelom
porovnávacie štúdie serologických a molekulárne biologických vyšetrení
využiť / zamerať sa pritom na tzv. kritickú populáciu: domovy dôchodcov, zdravotníckí pracovníci, rómske osady, a pod. ( z dôvodu vyššej frekvencia výskytu prípadov )
Literatúra
Lippi G, Plebani M: Laboratory abnormalities in patients with COVID 2019 infection, Clin Chem Lab Med. 2020 Mar 3. doi: 10.155/cclm-2020-0198 ( E pub )
Center for Diseases Control and Prevention: Interim Guidelines for Collecting, Handling and testing Clinical Specimens from Patients for Coronavirus Disease 2019: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-nCoV/lab/guidelines-clinical-specimens.html
Wu Z., Mc Gregor JM: Characteristics and Important Lessons From teh Coronavirus Disease 2019 ( COVID-19 ): Outbrake in China: Summary of a report of 72 314 Cases From the Chinese Center for Disease Control and Prevention: JAMA, 2020, Febr 24.doi:10.1001/jama.20202648 ( E pub )
Lippi G, Plebani M: The Novel Coronavirus ( 2019 nCoV ) outbreak: think the unthinkable and be prepared to face the challenge. Diagnosis ( Berl ).2020, Jan.28.doi:10.1515/dx-2020-0015. ( E pub )
WHO Coronavirus diseases 2019 ( COVID-19 ) Situation report-44: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports/
Mattiuzzi C, Lippi G: Which lessons shall we learn from the 2019 novel coronavirus outbreak ?, Ann Trans Med 2020, 8(3):48.
Thang H et all: Angiotensin converting enzyme 2 ( ACE2 )as a SARS-CoV-2-receptor: molecular mechanisms and potential therpautic target: Intensive Care Med., 2020, Mar 3.doi: 10.1007/s00134-020-05985-9 ( E pub )
Kannan S, Shaik syed ali P, Sheeza A, Hemalatha K. COVID-19 (Novel Coronavirus 2019) - recent trends. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2020;24(4):2006-2011.
Chan JF, Yip CC, To KK, et al. Improved molecular diagnosis of COVID-19 by the novel, highly sensitive and specific COVID-19-RdRp/Hel real-time reverse transcription-polymerase chain reaction assay validated and with clinical specimens. J Clin Microbiol. 2020;
Tan SS, Yan B, Saw S, et al. Practical laboratory considerations amidst the COVID-19 outbreak: early experience from Singapore. J Clin Pathol. 2020;
Pfefferle S, Reucher S, Nörz D, Lütgehetmann M. Evaluation of a quantitative RT-PCR assay for the detection of the emerging coronavirus SARS-CoV-2 using a high throughput system. Euro Surveill. 2020;25(9)
Corman VM, Landt O, Kaiser M, et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020;25(3)
Hlavaty T., Krajcovicova A: NOVEL UNORTHODOX STRATEGIES TO REDUCE THE CASE FATALITY RATE OF COVID-19 IN HIGH RISK GROUPS INCLUDING PATIENTS USING ACE INHIBITORS: www.researchgate.net/publication/340135640
pozri www.laboratornamedicina.sk časť „Blog“